6月23日-26日，第五届中华儿科临床检验”钱江论坛“在四川成都召开。论坛特别邀请了业内著名专家莅临授课，内容涵盖儿童生长发育、新型冠状病毒、儿童精细化输血治疗以及临床实验的最新进展。这将对检验界带来积极的指导意义，在学习强国的道路上以实际行动为建党100周年献礼。
在6月25日上午的主会场上，来自复旦大学附属妇产科医院妇科遗传中心的徐晨明主任针对“数字PCR技术在出生缺陷防控中的应用”这一主题进行了专题发言。
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出生缺陷出生缺陷也叫先天异常，先天畸形。定义为：婴儿出生前发生的身体结构、功能或代谢异常。主要病种有：先天畸形、染色体异常、遗传代谢性疾病、功能异常如盲、聋和智力障碍等。主要有三个影响因素：遗传因素、环境因素和母体因素。全世界每年大约有790万出生缺陷婴儿降生，平均每5~6分钟就有一个，90%以上发生在发展中国家。我国先天残疾儿童总数高达90万，占我国出生人口总数的5.6%。严重的畸形可导致胎儿/新生儿死亡或严重残疾。在中国的大城市，出生缺陷也已是围产儿和婴儿死亡的主要原因，每30s就有一个缺陷儿出生。据估计因此中国每年造成的经济损失超过200亿元。
出生缺陷的三级防控：①一级防控：婚前、孕前。防止出生缺陷儿的发生②二级防控：产前。减少严重缺陷儿的出生③三级防控：新生儿、儿童。缺陷患儿出生后一早诊断早治疗。综合实施三级综合防控可以预防和控制60%~70%的出生缺陷，有利于降低婴儿死亡率，提高出生人口素质，提高人均寿命预期！
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02
数字PCR—一种核酸分子绝对定量技术目前PCR技术已迭代了三代。第一代PCR技术只能做定性分析。qPCR是第二代PCR技术，可以进行定量，但受限于原理其检测灵敏度一般只能达到1%左右的水平。数字PCR（dPCR）是第三代PCR技术，通过将PCR反应体系分割成数以万计的反应单元进行单独扩增，然后再通过数学方法实现绝对定量，理论上可以实现单分子的精确定量，具有很高的灵敏度和准确性。
数字PCR的检测流程一般包括以下步骤：含有目标核酸样本模板的PCR体系被分成许多小体积的小室中，其中模板分子是随机分布的。每个小室具有0个，1个或多个分子，并且符合泊松分布的规律。因此通过反应后的阳性液滴数和阴性液滴数就可以计算得到对应初始模板的拷贝数，最低可实现单拷贝的定量。还可以对样本拷贝数和分区数进行计算来评估定量的准确程度。数字PCR的高灵敏度和绝对定量，以及跟qPCR类似的操作和成本，使这种技术在临床诊断领域有着巨大的应用潜力。
03
PCR在出生缺陷中的应用软骨发育不全 (Achondroplasia, ACH)，临床常见的骨发育异常，也是侏儒症最常见的原因之一。患者除了头大或伴有面中部发育不全的特征性面容、四肢短小外，常常有渐进性椎管狭窄引起颅内高压从而导致中枢神经系统疾病以及一些呼吸系统疾病，这是造成患者死亡的重要原因。
尽早筛查与诊断，是目前降低软骨发育不全有效的方法。中国人民解放军总医院收集66例临床样本盲测，进行胎儿软骨发育不全无创产前基因检测和羊水Sanger验证，共检测出FGFR3基因突变的阳性样本11例，阴性样本55例，检测结果与羊水Sanger验证结果一致率100%。
脊肌萎缩症是目前最常见的常染色体隐形遗传病之一，它是由脊髓前角运动神经元变性导致肌无力、肌萎缩。脊髓性肌萎缩症是2岁以下婴幼儿群体中的头号遗传病杀手，活婴发病率约为1/6000-1/10000，中国人群携带率为1/42。Spinraza是全球首个获批治疗脊髓性肌萎缩症的药物，2019年已于中国获批上市，但是价格极其昂贵。
由于脊肌萎缩症是常染色体隐性遗传病，现有的检测方法为对于有遗传病史的夫妻先进行基因诊断，再对于高风险孕妇进行羊水穿刺筛查或绒毛穿刺筛查。
山东大学的科研团队针对外周血、羊水、脐血、绒毛进行了数字PCR和常规的MLPA验证对比实验。实验样本包括了29例SMN1基因第7外显子纯合缺失、84例杂合缺失，以及25例未见缺失。同MLPA检测结果比较，符合率达100%。这证明数字PCR技术对于SMN1基因拷贝数的检测是准确、快速、经济的，可满足SMA临床基因检测和产前诊断的需求。
胎儿溶血症是一种免疫性溶血病。其主要临床表现为黄疸、水肿、贫血、肝脾肿大，溶血严重时可导致胎死宫内、中枢神经病变、核黄疸、心力衰竭或新生儿死亡，幸免于死的，则可遗留脑性瘫痪，导致终生残疾。胎儿溶血症发病率为十万分之3-80，胎儿溶血症的治疗与其他出生缺陷相比相对成熟，通常对胎儿溶血症新生儿给予及时的蓝光治疗、药物、交换输血治疗。
胎儿溶血症现有的检测方法包括夫妻血型检查、羊水检查、B超观察。
来自法国的一个科研团队用数字PCR检测cffDNA与从绒毛膜绒毛或羊水中提取的胎儿DNA进行验证对比，基因覆盖了RHD的第4，5，7，10外显子。虽然样本量较少，但未检测到任何假阳性和假阴性，说明了数字PCR得益于其高灵敏度，未来应用于从母血进行常规产前胎儿 RHD 基因分型的可行性。
唐氏综合症是由21号染色体异常而导致的疾病。60%患儿在胎内早期即流产，存活者有明显的智能落后、特殊面容、生长发育障碍和多发畸形。新生儿的发病率约为1/600-1/800，目前没有有效的治疗方法。
复旦附属妇产科医院妇科遗传中心目前引进了一种名为“UM1000”的超多重数字PCR技术。可实现单一反应体系内上百重甚至近千重PCR扩增，全面覆盖21、18和13染色体。配合成熟的数字PCR技术，可以在样本量相对稀有的情况下保证染色体拷贝数定量的准确度，满足了唐氏综合症筛查的技术需求。
在筛查中，阴性预测值往往意味着漏检程度。而就目前的检测结果来说，不管是国内还是国外开展的实验，都没有检测到假阴性的情况，阴性预测值100%意味着极低的漏检率。这一点对于产前诊断来说是极其重要的。目前正在与技术开发方进行紧密的合作，期待未来产品的早日面市。
04
展望目前，我国对出生缺陷采取了“三级防治”的策略，第一级主要是婚前和孕前，第二级主要是产前筛查和诊断，第三级主要就是新生儿疾病筛查。经过多年综合防治，我国22种重大出生缺陷疾病的发生率已大幅下降。但目前由于成本等因素的考量，医保尚未覆盖NIPT等无创筛查项目。数字PCR技术的创新有助于推动精准无创的出生缺陷筛查在我国更广大地区的广泛普及。我们也希望有更多的新技术和新产品进入这个领域，大家一起来更好地减少出生缺陷的发生。
